Hyplex Multiplex-Plattformtechnologie: Teil 1. Die wohl wichtigste und effektivste Maßnahme gegen eine Übertragung bzw. Verbreitung von Krankheitserregern in Krankenhäusern ist die ausnahmslose und vor allem schnelle Isolierung der besiedelten oder infizierten Patienten.
Konventionelle mikrobiologische Kultivierungstechniken benötigen wenigstens 48 Stunden für ein positives oder negatives Ergebnis.
In der mikrobiologischen Routinediagnostik kann sich dieser Zeitraum aufgrund zusätzlich notwendiger Bestätigungstests oftmals auf drei Tage und mehr ausdehnen.
Moderne molekularbiologische Diagnostika stellen hier einen viel versprechenden Lösungsansatz dar.

Der Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat das Feld der Diagnostik infektiöser Erkrankungen revolutioniert.
Um den Nachteil der relativ hohen Kosten einer einzelnen Nachweisreaktion zu umgehen und gleichzeitig die Kapazität der Verfahren zu erhöhen, wurden sog. Multiplex-PCR-Systeme entwickelt.
Bei dieser modifizierten Form der PCR können in einem Reaktionsansatz und in einem Reaktionsgefäß simultan mehr als nur eine Zielsequenz mit einer Kombination aus verschiedenen Primer-Paaren vervielfältigt werden.
Zur Anwendung gelangen solche Multiplex-PCR-Verfahren beispielsweise in der Differentialdiagnostik infektiöser Erkrankungen (verschiedene Erreger mit ähnlicher klinischer Symptomatik) oder zur Identifizierung eines Erregers mit bestimmten, pathogenetisch relevanten Eigenschaften (z.B. Toxine oder Adhäsionsfaktoren).
Ein aktuelles Beispiel für den Einsatz PCR-basierter Multiplex-Verfahren im Bereich der Infektiologie bzw. der Krankenhaus-Hygiene ist der Nachweis Methicillin-resistenter Stämme von Staphylococcus aureus.
Zur molekularbiologischen Identifizierung eines „MRSA“ bzw. „cMRSA“ (community-aquired MRSA) ist es notwendig, mittels PCR-basierter Verfahren sowohl das Vorhandensein von S. aureus (MRSA/cMRSA) als auch das eventuelle Vorliegen einer Mischkultur mit S. epidermidis (MRSE) abzuklären sowie die fragliche Resistenz gegen Methicillin und des für cMRSA-charakteristischen Toxins PVL (bzw. der für die Resistenz und das Toxin kodierenden Nukleinsäuren) nachzuweisen oder auszuschließen.
PCR-basierte Nachweisverfahren ermöglichen eine signifikante Verkürzung des Zeitfensters von der Entnahme des Abstrichs bis zur Diagnosestellung auf wenige Stunden.
Dieser Zeitgewinn wird durch den Verzicht auf Vorkultivierung des Erregers erreicht, da diese aufgrund der hohen Sensitivität der PCR entfallen kann.
Im konkreten Fall kann der Zeitgewinn einerseits dazu beitragen, durch die rasche Identifizierung unbekannter MRSA/cMRSA-Träger und deren Isolierung im Krankenhaus Kosten für die Behandlung nosokomialer Wundinfektionen und weiterer, daraus resultierender Maßnahmen zu vermeiden.
Andererseits kann der Erfolg von Sanierungsmaßnahmen bei bekannten Trägern schneller erkannt und unnötige Kosten für deren Isolierung vermieden werden.

Spezifität und Sensitivität NAT-basierter Verfahren
Molekularbiologische Nachweisverfahren, die auf der Vervielfältigung von Nukleinsäuren basieren (nucleic acid amplification technology – NAT), zeichnen sich durch ihre hohe Spezifität und Sensitivität aus.
Ermöglicht wird diese Spezifität durch den Einsatz molekularer Sonden (meist synthetische Oligonukleotide), die sich sequenzspezifisch an Nukleinsäuren (z.B. erregerspezifische RNA oder DNA) binden können.
Die betreffenden Bereiche können dann mittels verschiedener NAT-Verfahren wie beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder NASBA vervielfältigt und schließlich identifiziert werden.
Nachweisverfahren aus der hyplex-Familie bauen auf PCR- und ELISA-Technologien auf.
Hyplex-Nachweisverfahren basieren auf dem oben beschriebenen Multiplex-PCR-Prinzip.
Die Auswertung der Multiplex-PCR erfolgt in einer nachgeschalteten reversen Hybridisierungsreaktion nach dem ELISAPrinzip mit farbcodierten und frei kombinierbaren Kavitäten, die eine unabhängige und individuelle Analyse der einzelnen Parameter ermöglichen.
Durch den Einsatz der spezifischen „Fangsonden“ wird zudem die hohe Spezifität der Systeme sichergestellt. Das Prinzip der hyplex- Nachweisverfahren ist schematisch in der Abbildung 1 dargestellt.
Seit Anfang 2003 bietet die Firma BAG (BiologischeAnalysensystemGmbH, Lich) weltweit als erste Firma ein Multiplex-PCR-ELISA-System (hyplex StaphyloResist) für das direkte MRSA-Screening von Abstrichtupfern kommerziell an.
Dieses System wurde Mitte 2003 in unserer Gemeinschaftspraxis prospektiv an 407 Proben parallel zur mikrobiologischen Routinediagnostik getestet und wird seitdem routinemäßig angeboten und durchgeführt. 95,6 % aller MRSA-Träger konnten bereits fünf Stunden nach Probeneingang identifiziert werden und die restlichen 4,4 % am folgenden Tag.
Es gab keinerlei falschpositive oder falsch-negative Resultate.
Es zeigte sich zudem, dass jeweils ein Nasen- und ein Rachenabstrich (ggf. ein Wundabstrich) für ein effektives Screening ausreichend waren.
Zusätzliche Achsel-, Leistenoder Perianal-Abstriche erbrachten keine weiteren Erkenntnisse.

Kontakt:
Priv.-Doz. Dr. Fritz Schwarzmann
Medizinisches Versorgungszentrum
Dr. Tiller & Kollegen
Abteilung „Molekulare Diagnostik"
D-München
Tel.: 089/543080
Fax: 089/54308120
f.schwarzmann@labortiller.de
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