Medizinisches Versorgungszentrum: Hyplex Multiplex-Plattformtechnologie. Der Focus der von der Firma BAG (BiologischeAnalysensystemGmbH, Lich) vertriebenen hyplex-Teste liegt auf dem Gebiet der Diagnose von auf sexuellem Weg übertragbarer Erkrankungen (Chlamydien, Myko- und Ureaplasmen) und dem Nachweis bedeutender epidemisch/endemisch auftretender Erreger (enterohämorrhagische E. coli, Methicillin-resistente Staphylokokken, multiresistente Enterokokken und Bakterien mit einem erweiterten Spektrum an Resistenzen gegen ß-Laktam-Antibiotika –ESBL) (siehe Tab. 1).

Hyplex-Systeme sind aus vergleichbaren Modulen zusammengesetzt und bestehen aus zwei Komponenten: Erstens, PCR-Module, die markierte Oligonukleotid-Primer enthalten und somit eine simultane Amplifikation eines Erreger-spezifischen DNS-Bereichs sowie einer internen Kontrolle in einer einzigen PCR-Reaktion ermöglichen. Zweitens, Hybridisierungsmodule, mit denen die in einer einzigen Reaktion (Multiplex-PCR) gebildeten Amplifikate individuell nachgewiesen werden. Dazu werden die Amplifikate aus der Multiplex-PCR hitzedenaturiert und zu einzelsträngigen, spezifischen Sonden gegeben, die an der Polystyroloberfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert sind. Unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers findet eine Hybridisierung komplementärer Sequenzen statt, die nachfolgend mittels ELISAPrinzip bei einer Wellenlänge von 450 nm detektiert werden kann. Diese „reverse Hybridisierung“ kann vollautomatisch mittels ELISA- Prozessoren durchgeführt werden. In unserem Labor wird dazu der Personal Lab (Fa. Adaltis, Freiburg) verwendet. Ein großer ökonomischer Vorteil der hyplex-Plattform ist die Tatsache, dass alle Testsysteme identische PCR-Protokolle und Hybridisierungsbedingungen verwenden. Dies bedeutet, dass alle mit den jeweiligen Systemen zu testenden Proben miteinander durchgeführt werden können, d.h. EHEC-Testungen können z.B. mit den MRSA-Screening- Untersuchungen gemeinsam prozessiert werden. Für unser Routinelabor wird damit die Durchführung einer großen Probenanzahl mit minimalem Zeit- und Personalaufwand ermöglicht, die uns „modernere“ Technologien wie RealTime-PCR-Nachweise nicht bieten können. Zwar sind diese Verfahren ebenfalls in der Lage, durch Verwendung von Sonden mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen und Schmelzpunktanalyse der Amplifikationsprodukte eine Reihe von Parametern zeitgleich zu erfassen und individuell auszuwerten. Limitiert ist diese Technologie aber durch die relativ hohen Kosten für die mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten Sonden, die Nachweisgeräte (Lightcycler) und die geringe Kapazität der Geräte.

Hyplex-Nachweise verwenden „echte“ interne Kontrollen

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit einerseits und der systembedingten Störanfälligkeit enzymbasierter NAT-Nachweisverfahren andererseits ist es unerlässlich, durch Extraktions- und Pufferkontrollen auf mögliche Verunreinigungen zu testen und mittels Positivkontrollen das Unter su chungs material auf Inhibitoren zu kontrollieren, um falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu vermeiden. Bei Untersuchungen, die mit Probenmaterial stark unterschiedlicher Qualität durchgeführt werden müssen, wie beispielsweise der Nachweis infektiöser Erreger in Abstrichen, ist es außerdem wichtig, falsch negative Ergebnisse, die nicht auf einer Hemmung der PCR beruhen, zu erkennen. Aus dieser Überlegung heraus wird z.B. im hyplex-STD-System parallel eine „echte“ interne Kontrolle durchgeführt, bei der humane DNS amplifiziert wird. Wie bei „artifiziellen“ internen Kontrollen, die in anderen NAT-Systemen vor der Aufreinigung der Nukleinsäuren dazugegeben werden, ist es somit möglich, den Aufreinigungsvorgang zu kontrollieren und eine Hemmung der beteiligten Enzyme zu erkennen. Die „echte“ interne Kontrolle der hyplex-Nachweise erlaubt es zusätzlich, falsch negative Ergebnisse aufgrund unzureichender Qualität des Untersuchungsmaterials (beispielsweise Abstriche mit wenig Zellmaterial, degradierte Materialien) zu erkennen und auszuschließen. Im Rahmen einer von uns durchgeführten vergleichenden Studie haben wir 250 klinische Proben auf Chlamydia trachomatis-DNA untersucht. Das Ziel der Studie war, die Leistungsdaten des hyplex STD Chlamydia-Systems mit denen eines etablierten Nachweisverfahrens zu vergleichen. Dieses etablierte System verwendete eine „artifizielle“ interne Kontrolle, um Probleme bei der Aufreinigung und inhibitorische Substanzen zu erkennen. In dieser Studie konnten wir mit dem hyplex STD Chlamydia-System sieben Proben als „ungeeignetes Material“ ausschließen, da kein Signal der „echten internen“ Kontrolle nachweisbar war (eingereicht zur Publikation). Mit dem etablierten Verfahren wurden diese sieben Proben dagegen als „negativ“ eingestuft. Da keine Nachtestung der betroffenen Patienten möglich war, konnte ein falsch negatives Ergebnis mit dem etablierten Verfahren nicht ausgeschlossen werden.

Resümee

Die hyplex-Multiplex-Plattformtechnologie ermöglicht kostengünstige high throughput-Testungen auf der Basis hoch-sensitiver NAT-Nachweise. Wird das System, das in seiner Minimalversion nur einen Thermocycler benötigt, zur Auswertung der Multiplex- PCR vollautomatisch mittels ELISA-Prozessoren durchgeführt, eignen sich die Verfahren zur Untersuchung großer Probenaufkommen. Die Konzeption und der einheitliche Aufbau der Verfahren (identische PCR-Protokolle, gleiche Hybridisierungsbedingungen) ermöglichen es, verschiedene Nachweise parallel auf einem Gerät durchzuführen, was eine weitere Verkürzung der Diagnostik-Zeit und ökonomische Ersparnis bedeutet. Die hyplex-Multiplex-Plattformtechnologie transferiert diagnostische Leistungen, die früher nur in Spezial-Labors durchgeführt werden konnten, in das standard-ausgerüstete Routinelabor.