Raman-Technologie: Laboranalysen mit Laserlicht. Der selektive und sensitive Nachweis von Proteinen durch markierte Antikörper spielt eine zentrale Rolle in der modernen Bioanalytik und biomedizinischen Diagnostik. Die simultane Vielfachdetektion (Multiplexing) von Proteinen als Zielmoleküle eröffnet dabei völlig neue Möglichkeiten hinsichtlich Zeit, Kosten und Datenqualität. Dies gilt besonders für Anwendungsgebiete wie die Klinische Chemie und die Immun-Diagnostik. In diesem Beitrag wird die Raman/ SERS-Technologie vorgestellt, welche ein enormes Multiplexing- Potential besitzt.

Derzeit ist die ELISA-Technologie das am häufigsten eingesetzte Immunassay- Verfahren. Mit einem Fängerantikörper wird das Zielprotein zunächst immobilisiert, anschließend wird durch einen enzymmarkierten Detektionsantikörper ein farbiges Produkt erzeugt; dieses kann spektralphotometrisch quantifiziert werden. ELISAMethoden sind relativ kostengünstig, einfach durchzuführen, quantitativ sowie sensitiv. Allerdings lässt sich pro Messung immer nur auf ein bestimmtes Zielprotein testen. Will man auf eine ganze Reihe von Zielproteinen testen, dann muss man eine Serie von separaten Messungen durchführen. Diese sequentielle Vorgehensweise kostet Zeit und verlangt ein entsprechend größeres Probenvolumen. Im Gegensatz zu sequentiellen Messungen erlauben simultan durchgeführte Messungen die Protein-Konzentrationsbestimmung in einem einzelnen Experiment.

Eine Parallel-Erfassung spart somit Zeit und Kosten. Je höher die Multiplexing-Kapazität ist – die Anzahl der gleichzeitig in einer Messung bestimmbaren Proteine – desto besser. Abb. 1 gibt eine Übersicht der Multiplexing- Kapazitäten derzeit verfügbarer Technologie-Plattformen. Aufgeführt ist auch der jeweils zugrunde liegende physikalisch-chemische Prozess. Bei ELISA-Verfahren wird immer nur ein Protein pro Messung nachgewiesen (Abb. 1 links). Fluoreszenzbasierte Technologien mit konventionellen Fluorophoren sind auf den Nachweis von typischerweise 1-3 Zielmolekülen beschränkt (Abb. 1 Mitte). Die neuere Technologie der Quantendots erlaubt den Nachweis von ca. 3-10 Proteinen; dies stellt somit gegenüber konventionellen Fluorophoren bereits eine deutliche Verbesserung dar, kann aber bei weitem nicht mit dem Potential der Raman-Spektroskopie konkurrieren (Abb. 1 rechts).

Molekularer Fingerabdruck mittels Raman-Spektroskopie

Die Raman-Spektroskopie ist eine schwingungsspektroskopische Methode und arbeitet, wie die Fluoreszenz- Spektroskopie, mit Laseranregung; allerdings wird bei der Raman-Spektroskopie durch inelastische Lichtstreuung ein ganz charakteristisches Spektrum der untersuchten Substanz mit detaillierter molekularer Information erhalten: man erhält somit einen „molekularen Fingerabdruck“ oder „Strichcode“ für jeden Raman-Marker. In Kombination mit Edelmetallnanopartikeln erfolgt die Detektion von Markermolekülen über eine ultrasensitive Methode, welche als Oberflächen- verstärkte Raman-Streuung (SERS: Surface-enhanced Raman Scattering) bezeichnet wird. Die innovative Technologie der hochsensitiven Raman/SERS-Markierung kann zum simultanen und quantitativen Protein-Nachweis in allen Bereichen der Bioanalytik und medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.

Alleinstellungsmerkmal dieser neuen Technologie-Plattform ist ihr im Vergleich zu Fluoreszenz- Techniken herausragendes Multiplexing- Potential zur gleichzeitigen Detektion von bis zu 100 Zielmolekülen. Resultat ist ein enormer Zeit- und Kosten-Vorteil im Vergleich zu vielen separaten Einzelmessungen. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass dieser Multiplexing-Ansatz nur einen Bruchteil des Probenvolumens verglichen mit entsprechenden ELISA- Ansätzen benötigt. Ursache des enormen Multiplexing-Potentials der SERS-Marker ist die intrinsisch geringe Linienbreite von Raman- Banden im Vergleich zu Fluoreszenz- Emissionsbanden. Die Quantifizierung der Proteinkonzentration ergibt sich direkt aus dem Spektrum des jeweiligen Raman/SERS-Markers. Diese neue Technologie kann prinzipiell in fast allen Bereichen anstelle von Fluorophoren zur Markierung eingesetzt werden.

Aufgrund der inelastischen Lichtstreuung kommt es zu keinem Photobleichen der Probe, so dass man diese mehrmals hintereinander vermessen und auch lagern kann. Zudem wird für die Signalerzeugung bei einer ganzen Marker-Serie nur eine einzige Laserquelle bzw. Wellenlänge benötigt. Arbeitet man mit Nahinfrarot- Anregung, so lässt sich durch die Minimierung der Autofluoreszenz zudem ein sehr hoher Kontrast von Signal zu Hintergrund erzielen. Ein weiteres sehr viel versprechendes Anwendungsgebiet ist die SERS-Mikroskopie als neues bildgebendes Verfahren zur simultanen Lokalisierung von mehreren Zielproteinen in Zellen und Geweben.