Dual-Target-Detektion bietet sich grundsätzlich an, wenn der nachzuweisende Erreger aufgrund seiner biologischen Variabilität häufig genetische Polymorphismen bildet. Seit Februar 2009 ist erstmalig ein quantitativer Cobas TaqMan HIV-1-Test im deutschen Markt verfügbar, der auf dem Prinzip der Dual-Target-Detektion basiert.

Die hohe Fehlerrate der retroviralen Transkriptionsprozesse sowie Medikamente und das Immunsystem als starke Selektionsfaktoren führen beim Humanen Immundefizienz Virus (HIV) zu einer enormen Flexibilität in der genetischen Ausstattung. Dies hat weitreichende Konsequenzen für die Medizin: Viele Medikamente werden aufgrund von Resistenzen unwirksam, und molekulardiagnostische Nachweisverfahren müssen immer mehr genetische Varianten erkennen können.

Aus diesen Gründen hat Roche bereits Anfang der 1990er Jahre ein Global Surveillance-Programm etabliert, in dem HIV-Sequenzen der Los Alamos-Datenbank erfasst und durch klinische Proben aus internationalen Kooperationen kontinuierlich ergänzt werden. Der Bestand ist bereits auf über 10.000 Sequenzen angewachsen. Parallel dazu wurden die PCR-Reagenzien weiterentwickelt, um nicht nur eine annähernd 100 %-ige Testspezifität, sondern zugleich auch eine hohe Sensitivität zu erreichen. Denn für ein möglichst sicheres Therapiemonitoring der HIV-Infektion fordert die S3-Leitlinie der Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften (AWMF, www.awmf-leitlinien.de), für die Quantifizierung der HIVRNA den sensitivsten erhältlichen Test einzusetzen.

Testeigenschaften

Mit einer Sensitivität von 20 HIV-1 Kopien/ml erfüllt Cobas Ampli- Prep/Cobas TaqMan HIV-1-Test, v2.0 als CE-IVD markierter kommerzieller Test diesen hohen Anspruch. Da der Test einen linearen Bereich von 20 bis 107 Kopien/ml aufweist, kann der HIV-1 Titer auch bis zur Nachweisgrenze quantifiziert werden (Abb. 1). Ermöglicht wird diese Testperformance durch das Dual-Target-Prinzip. In der Version 2.0 des Cobas AmpliPrep/ Cobas TaqMan HIV-1-Tests werden zwei hochkonservierte Regionen der HIV-1 RNA in einer Multiplex- Real-Time-PCR simultan erfasst: Vier Primer amplifizieren ein 154 bp-Produkt in der GAG-Region, und drei Primer amplifizieren ein 134 bp-Produkt im nicht-codierenden 5’-Ende, der späteren LTR-Region des Provirus.

Die targetspezifischen Sonden sind beide mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM markiert und generieren summiert ein höheres Fluoreszenzsignal als bei Nachweis nur eines Targets (Abb. 2). Da Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1-Teste auf den 1. Internationalen Standard der World Health Organization standardisiert sind, und die höheren Fluoreszenzwerte von der Software zur Virustiter-Berechnung berücksichtigt werden, korrelieren quantitative Ergebnisse der Version 2.0 sehr gut mit denen der Version 1.0 (R2= 0,936).

Vorteile des Dual-Target-Prinzips

Ein weiterer Vorteil des Dual-Target- Prinzips ist neben der Erfassung der HIV-1-Gruppe M (Subtypen A-H) die neue Inklusivität der HIV-1 Gruppe O und eine prinzipiell höhere Testsicherheit bei genetischer Variabilität des HIV-1. Über die Mismatch-Toleranz hinausgehend, die mit mehreren Primern pro Target und über chemische Modifikationen der Nukleotide erreicht wird, erkennt die Dual-Target-Detektion auch HIV-1-Varianten mit bisher unbekannten Polymorphismen.

Der quantitative HIV-1 Test v2.0 ist auf dem Analysesystem Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 48 und der vollautomatisierten Hochdurchsatz- Variante Cobas AmpliPrep/ Cobas TaqMan einsetzbar. Workflow und Testzeiten bleiben im Vergleich zur Version 1.0 unverändert. 22 Autor: Dr. Andrea Hülsen Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 22 Kontakt: Dr. Monika Mölders Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Tel.: 0621/759-4746 Fax: 0621/759-6074 Monika.Moelders@Roche.com