Elektrochemische DNA-Sensoren: Alternative zu Fluoreszenz-basierten Systemen. Der Nachweis von spezifischen DNA-Sequenzen wird in vielen Anwendungsbereichen immer mehr zu einem wichtigen Instrument der Analytik. Elektrochemische DNA-Sensoren bilden eine relativ einfache Alternative zu Fluoreszenz-basierten Systemen, gerade wenn der Nachweis einer begrenzten Anzahl von DNA-Abschnitten im Fokus steht.

Seit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms treten die Analyse und der Nachweis von DNA immer deutlicher in den Mittelpunkt des Interesses der Forschung. Nicht nur die Aufklärung von Verwandtschaftsverhältnissen anhand der Analyse von DNA-Sequenzen (z. B. der Vaterschaftstest) oder der Nachweis von genveränderten Pflanzen oder Mikroorganismen z. B. in Lebensmitteln sind dabei besonders interessant. Auch die Erkennung von spezifischen DNA-Sequenzen zur Identifizierung relevanter pathogener Spezies ist ein Themengebiet der aktuellen Forschung. Zudem unterstützt die Erkennung von genetisch bedingten Krankheiten in der medizinischen Forschung die Entwicklung spezieller Therapien.

Innerhalb der letzten Jahrzehnte wurden verschiedene Ansätze zur Identifizierung von DNA-Sequenzen verfolgt und zahlreiche Methoden entwickelt. Dabei setzten sich hauptsächlich zwei Methodengruppen durch: Zum einen die zeitaufwändige DNA-Sequenzierung, bei der die Nukleotidfolge eines DNA-Strangs sequenziell bestimmt wird, zum anderen der Nachweis der Hybridisierungsreaktion von DNA-Einzelsträngen. Dieser basiert auf der spezifischen Basenpaarung zweier komplementärer DNA-Sequenzen. Der Hybridisierungsnachweis erfolgt dabei durch optische, enzymatische, massesensitive oder elektrochemische Verfahren.

Aufbau und Prinzip

Dem Hybridisierungskonzept folgend besitzen alle DNA-Biosensoren den gleichen Aufbau: Ein DNA-Fängerstrang (Probe) wird auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Durch den Kontakt mit der komplementären Ziel-DNA (Target) erfolgt die Hybridisierung.

Seit etwa 20 Jahren finden Fluoreszenz-basierte DNA-Biochips – insbesondere DNA-Microarrays – immer breitere Anwendung in der molekularbiologischen DNA-Analyse. Beim Auslesen dieser oft hochparallelen Einheiten werden die als Markierung der Ziel-DNA gekoppelten Fluorofore angeregt. Die entstehenden Fluoreszenzsignale können gemessen werden. Eine Quantifizierung der Ziel-DNA erfolgt über die verschiedenen Intensitäten der gemessenen Signale.

Alternativ zur dieser optischen DNA-Detektion wurden im letzten Jahrzehnt verschiedene elektrochemische DNA-Biosensoren entwickelt. Bei diesen Sensoren ist die biologische Erkennungseinheit direkt mit einem physikalischen Signalgeber verbunden, der die Hybridisierungsreaktion in ein elektrochemisches Messsignal umwandelt, das dann elektronisch weiterverarbeitet werden kann.

Vorteile

Beim DNA-Nachweis durch Fluoreszenzdetektion ist es möglich, parallel und simultan einige zehn- bis hunderttausend DNA-Stränge nachzuweisen. Das Auslesen der Daten und die dabei entstehenden Datenmengen sind jedoch nur mit hohem apparativen Aufwand und geschultem Personal zu bewältigen. Weiterhin erfordert die klinische Diagnostik häufig die Analyse spezifischer Parametersets statt eines weiten Screenings. Neben dem hohen Kostenaufwand und der speziellen instrumentellen Ausstattung stellen auch die teilweise ungleichmäßige Probenmarkierung und das Ausbleichen des Farbstoffes applikative Probleme dar.

Bei elektrochemischen DNA-Sensoren ist der apparative Aufwand zur Messung und Datengewinnung hingegen geringer, und es können prinzipiell einfache Nachweissysteme entwickelt werden. Zudem kann die Analyse des Targets je nach gewählter Messmethode zum Teil ohne vorherige Probenmarkierung erfolgen.

Bei der Entwicklung von elektrochemischen DNA-Sensoren wurden die verschiedensten Versuchsansätze verfolgt. Die Detektion von Einzelstrang- und Doppelstrang-DNA erfolgte z. B. durch die katalytische Oxidation von Guanin, das Einfügen von Interkalatoren in die dsDNA oder durch Markieren der Stränge mit Metall-Nanopartikeln. In den letzten Jahren fokussierte sich die Forschung, auch in der Forschungsgruppe der Hochschule Wildau, verstärkt auf die Detektion der Hybridisierung mithilfe von Redoxmarkern bzw. auf die labelfreie Detektion.

So wurden in der Arbeitsgruppe Goldfilmelektroden entwickelt, die mit thiolmodifizierter, kurzer Einzelstrang-DNA (z. B. 18mer ssDNA) verändert sind. Die Kopplung der Fänger-DNA erfolgt über eine Chemisorption der Thiolgruppen auf der Goldoberfläche. Unspezifisch an die Goldoberfläche gebundene ssDNA wird mithilfe der kurzen Thiolverbindung Mercaptobutanol (MCB) in einem Passivierungsschritt gelöst. Nach der Hybridisierung der Fänger-DNA mit Ziel-DNA ist eine Detektion mit verschiedenen Techniken, wie der voltammetrischen oder impedimetrischen Sensorauslese möglich.

Redoxumwandlung

Bei der DNA-Detektion mithilfe der Differenzpulsvoltammetrie (DVP) erfolgt der Nachweis der Hybridisierung des Fängers mit einer komplementären DNA-Sequenz über die Redoxumwandlung eines gebundenen Markers. Dieser Redoxmarker kann z. B. kovalent an die Ziel-DNA gebundenes Methylenblau (MB) sein. Ist die markierte Zielsequenz komplementär und Fänger-DNA und Ziel-DNA hybridisieren, erfolgt bei Ausprägung eines elektrischen Potenzials ein Austausch von Elektronen zwischen dem Redoxmarker Methylenblau und der Goldoberfläche. Bei einem reduktiven Scan geht Methylenblau dabei reversibel in die reduzierte Form, das Leukomethylenblau, über. Durch die Elektronenabgabe erfolgte ein Stromfluss, sichtbar durch einen charakteristischen Peak bei –260 mV. Im Versuchsaufbau zeigt der Sensor eine recht hohe Spezifität. Die unspezifische Bindung von nicht passfähiger MB-markierter Ziel-DNA konnte mit unter 10 % bestimmt werden. Der Peakstrom steigt mit zunehmender Menge an Ziel-DNA an und erlaubt so den quantitativen Nachweis von DNA.

Die Messung kann sowohl in einem direkten oder einem kompetitiven Ansatz erfolgen. Der kompetitive Ansatz bietet die Möglichkeit, auch ohne vorherige Markierung der Ziel-DNA zu quantifizieren. Dabei konkurriert die nicht markierte Ziel-DNA mit markierter komplementärer DNA um die Hybridisierungsplätze der Fänger-Stränge auf der Sensoroberfläche. Die untere Nachweisgrenze kann dabei über die Konzentration von MB-markierter DNA gesteuert werden. Bei Zugabe von 1 µM MB-DNA liegt die Nachweisgrenze bei etwa 3 nM. Die Nachweisgrenze des direkten Assays befindet sich bei etwa 30 nM DNA. Der spezifische Nachweis der Hybridisierung und die DNA-Quantifizierung werden noch durch die Nachweismöglichkeit einzelner Basenfehlpaarungen (single basepair mismatches) ergänzt. In Abhängigkeit von der Art und Lage der Fehlpaarung ergeben sich unter Sättigungsbedingungen für den gemessenen Peakstrom charakteristische Werte.

Impedanzspektroskopie

Eine weitere mögliche Detektion für die DNA-Hybridisierung bietet die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS). Dabei wird der Widerstand für die Redoxumwandlung eines Redoxsystems an einer Elektrode bestimmt. Beim impedimetrischen DNA-Nachweis erhöht sich bei der Wahl einer negativ geladenen Redoxspezies (z. B. Hexacyanoferrat [Fe(CN) 6 ] 3– und [Fe(CN) 6 ] 4– ) der Widerstand des Sensors nach erfolgter Hybridisierung. Durch die Hybridisierung des negativen DNA-Einzelstrangs mit dem ebenfalls negativ geladenen Zielstrang wird die Ladung auf der Oberfläche des Sensors deutlich erhöht. Negativ geladene Hexacyanoferrat-Ionen werden dadurch an der Abgabe und Aufnahme ihrer Elektronen an der Sensoroberfläche gehindert. Der zu messende Durchtrittswiderstand an der Elektrode erhöht sich deutlich. Dies kann in der so genannten Nyquist-Darstellung der Impedanz in einfacher Weise an der Zunahme des Durchmessers des Halbkreises erkannt werden und wird quantitativ durch eine Anpassung (Fit) der Messdaten anhand eines Ersatzschaltbildes ermittelt. Auch mit dieser Methode ist ein quantitativer DNA-Nachweis möglich. Das Detektionslimit für ein 18mer liegt bei 0,1 µM ssDNA. Parallel zur voltammetrischen DNA-Analyse ist es mit der Messung der Impedanz ebenfalls möglich, einzelne Basenfehlpaarungen zu detektieren. Die Lage und Art der Fehlpaarung bestimmt dabei die Veränderung des Durchtrittswiderstandes.

Der Vorteil der impedimetrischen DNA-Detektion ist, ähnlich dem kompetitiven voltammetrischen Ansatz, dass eine Markierung der Ziel-DNA nicht notwendig ist. Beim impedimetrischen Nachweis ist zudem grundsätzlich nach der Optimierung der Sensorherstellung und Analyse des Sensorverhaltens eine deutliche Reduzierung der zu messenden Frequenzen und damit eine Verringerung des Messaufwandes möglich.

Verbesserte Sensitivität und Stabilität

Die oben dargestellten DNA-Sensoren bilden die Grundlage für die Entwicklung weiterer Nachweissysteme für Nukleinsäuren. Es gelang im Rahmen eines Projektes an der Hochschule Wildau, voll regenerierbare und wieder einsatzfähige DNA-Sensoren herzustellen, die mit relativ geringem apparativen Aufwand bei Raumtemperatur präpariert und ohne Temperierschritte vermessen werden können. Die Sensitivität der Sensoren ist dabei ausreichend, um DNA aus Amplifizierungsprotokollen nachzuweisen. Selbst nach einer wochenlangen Lagerung sind die Sensoren noch einsetzbar. Aktuelle Forschungsprojekte befassen sich mit der Verbesserung der analytischen Leistungsfähigkeit dieser Messsysteme, insbesondere mit der Senkung der unteren Nachweisgrenze, der Vergrößerung der Arbeitsstabilität und der Erhöhung der Parallelität der Analyse. Gerade letzterer Punkt ist von besonderem Interesse z. B. bei der differenziellen Diagnostik von Infektionskrankheiten oder dem Nachweis bestimmter bioterroristisch relevanter Spezies.

Erfahrungen in der elektrochemischen DNA-Analytik dienen auch als Grundlage für die Entwicklung von Assays in anderen Anwendungsbereichen der Bioanalytik. So gelang es z. B. Autoantikörper, die bei Zöliakie (Glutenunverträglichkeit) vorhanden sind, mithilfe von impedimetrischen Sensoren kostengünstig, schnell und sensitiv nachzuweisen.