Molekulare Diagnostik humaner Papillomaviren. Der Pap-Test zeigt einen auffälligen Befund.
Was tun? Die Reaktionen reichen von panisch bis gelassen. Obwohl allein in Deutschland jährlich bis zu 7.000 Frauen die Diagnose Gebärmutterhalskrebs erhalten und wir mit jährlich ca. 3.000 Todesfällen mit an der Spitze in Westeuropa liegen, ist doch eher die zweite, die gelassene Reaktion angebracht.
Denn nach wie vor gilt, dass zwar fast jede sexuell aktive Frau irgendwann einmal eine HPV-Infektion durchgemacht hat, in über 95 % der Fälle waren die Viren jedoch nach wenigen Monaten bereits wieder verschwunden.
Bei den verbleibenden ca. 5 % der Frauen liegt meist eine Viruspersistenz vor, die es als solche zu erkennen und zu monitoren gilt, denn nur in dieser Konstellation kann das Virus seine onkogene Potenz entfalten.
Besonderes Augenmerk liegt hierbei auf den Hochrisiko-HPV-Typen, wobei allein 70 % der Gebärmutterhalstumoren auf das Konto der HPV-Typen 16 und 18 geht.

Spätestens seit der Eurogin-Konferenz im April 2006 in Paris ist es allgemein bekannt: Gleich zwei große Pharmakonzerne haben sich ein Kopf-an-Kopf-Rennen bei der Entwicklung einer HPV-Vakzine geliefert.
GSK wird einen bivalenten Impfstoff (HPV 16, 18) unter dem Namen Cervarix und Sanofi-Pasteur MSD einen quadrivalenten Impfstoff (HPV 16, 18, 6, 11) unter dem Namen Gardasil auf den Markt bringen.
Das Fachpublikum und die Referenten haben die Entwicklung der beiden Impfstoffe sehr positiv aufgenommen, und wenn die Prognosen zutreffen, werden Zervixkarzinome und Genitalwarzen bald der Vergangenheit angehören.
Das „bald“ ist hierbei im richtigen Maßstab zu sehen, denn ab Beginn einer Routineimpfung, in die schon Mädchen ab dem 10. Lebensjahr mit einbezogen werden sollen, kann es 30 Jahre und länger dauern, bis ein Impferfolg in Form eines signifikanten Rückgangs der Zervixkarzinomrate zu erkennen ist.
Zumindest mittelfristig wird daher, neben dem Pap-Test, die HPV-Diagnostik weiterhin das diagnostische Mittel der Wahl bleiben.
Hinsichtlich der Verfügbarkeit kommerzieller Testkits hat sich, nach einer langen Phase der Stagnation, nun doch endlich etwas getan auf dem Diagnosesektor.
Neben dem seit längerer Zeit etablierten HybridCapture 2-Test (Digene) stehen dem Anwender neue Tests zur Verfügung. Tests auf Basis des viralen mRNA-Nachweises, wie z.B. von NorChip, erregen zunehmend das Interesse des Fachpublikums.
Deren klinischer Nutzen muss jedoch noch in der Praxis gezeigt werden.
Ebenfalls neu auf dem Markt ist der Amplicor Human Papilloma Virus (HPV) und Linear Array HPV Genotyping-Test der Firma Roche Diagnostics.
Beide auf Basis der PCR-Technologie.
Diese haben wir im Routinebetrieb, auch bei größerem Probenaufkommen, getestet. Der Amplicor HPV-Test ist ein qualitativer in vitro-PCR-Test für den HPV-Nachweis in klinischen Proben.
Der Test erkennt die high-risk HPVTypen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68.
Der Linear Array (LA) Genotyping-Test kann aus derselben Präparation einen typspezifischen Nachweis einer Reihe low-risk (6,11,26,40,42,53,54,55,61,62,66,67,70, 72,73,81,82,83,84) und high-risk (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,6 8) HPV-Typen durchführen.
Das Testprotokoll des Herstellers sieht eine, in unseren Augen recht aufwändige, manuelle Probenvorbereitung vor. Wir haben daher den Test in unserem Labor auf eine automatisierte Plattform angepasst und beide Versionen an einem Panel von 256 Genitalabstrichen von Frauen mit leichten bis höhergradigen Läsionen miteinander verglichen (1).
 Die wesentlichsten Veränderungen von dem vorgegebenen Protokoll betrafen folgende Arbeitsschritte: Als Abnahme- und Transportsystem setzten wir den DNA cervical Sampler der Firma Digene und nicht das Flüssig-Zellkultur Medium PreservCyt von Cytyc oder SurePath von TriPath Imaging ein.
Die Extraktion der Nukleinsäure erfolgte automatisiert mittels MagNA Pure LC und nicht über das manuelle Verfahren mittels Vakuumpumpensystem der Firma Qiagen.
Auch die Detektion der PCR-Produkte im MTP-Format erfolgte automatisiert.
Hierfür setzen wir den Elisa Prozessor III der Firma Behring (BEP III) ein.

Die Auswertung der Ergebnisse lässt folgende Aussagen zu:
Das gängige Digene Abnahme- und Transportsystem ist uneingeschränkt auch für den Einsatz der Amplicor HPV-Testverfahren geeignet.
Nur ca. 1% der 256 Proben konnten aufgrund von PCR-Inhibition bzw. mangelnder Abstrichqualität nicht in die Auswertung aufgenommen werden.
Diese Proben konnten durch das Mitführen einer internen Kontrolle (ß-Globin) sicher identifiziert werden: Bei einer Übereinstimmung von insgesamt 92,6 % (110 x positiv und 124 x negativ) gehen wir von einer zumindest Gleichwertigkeit der beiden Protokolle aus, da auch die Auswertung der insgesamt 19 (7,4 %) diskrepanten Ergebnisse (sie wurden alle zusätzlich mittels LA nachgetestet) nicht zulasten des einen oder des anderen Protokolls ging.
Insgesamt wurden 64 der 110 positiven Proben mittels LA getestet und in allen 64 Fällen konnten HPViren des high-risk-Typs nachgewiesen werden (35 x nur 1 high-risk-Typ und 29 x multiple Infektionen mit mindestens 1 high-risk-Typ sowie low-risk HPV-Typen).
Ein signifikanter Vorteil für das automatisierte Protokoll mit MagNA Pure und BEP III wird deutlich, wenn man den erforderlichen Zeitaufwand, sowohl hinsichtlich der reinen Arbeitszeit als auch der Gesamtdauer des Tests der beiden Verfahren miteinander vergleicht. Durch diese automatisierte Aufarbeitung konnte signifikant Arbeitszeit eingespart werden (siehe Tabelle).
Neben dem Zeitgewinn ist auch der Zugewinn an diagnostischer Sicherheit durch die deutlich reduzierte Einflussnahme des Testpersonals auf den Testablauf ein wichtiger Aspekt.
Unter diesen optimierten Testbedingungen halten wir den Amplicor HPV-Test, auch für größere Serienlängen, für einen geeigneten Test zum Nachweis und zum Screenen von Genitalabstrichen auf Anwesenheit von HPV-DNA.
Das automatisierte Verfahren mittels MagNA Pure ist jedoch vom Anwender selbst zu validieren.

(1) Gunnar Schalasta, Tessa Rosenthal and Michaela Grothe (2006). Amplicor Human Papilloma Virus (HPV) Test.
A comparative analysis of two different nucleic acid extraction techniques. Eurogin, Paris 2006 (Po12-23).

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